նորություններ

IPTG-ն (իզոպրոպիլ-β-D-թիոգալակտոզիդ) β-գալակտոզիդազային սուբստրատի անալոգն է, որը բարձր ինդուկտիվ է:IPTG-ի ինդուկցիայի ներքո ինդուկտորը կարող է կոմպլեքս ստեղծել ռեպրեսորային սպիտակուցի հետ, այնպես որ ռեպրեսորային սպիտակուցի կոնֆորմացիան փոխվում է, այնպես որ այն չի կարող համակցվել թիրախային գենի հետ, և թիրախ գենը արդյունավետորեն արտահայտվում է:Այսպիսով, ինչպես պետք է որոշվի IPTG-ի կոնցենտրացիան փորձի ընթացքում:Որքան մեծ է, այնքան լավ:
Նախ, եկեք հասկանանք IPTG ինդուկցիայի սկզբունքը. E. coli-ի լակտոզային օպերոնը (տարրը) պարունակում է երեք կառուցվածքային գեն՝ Z,Y և A, որոնք կոդավորում են համապատասխանաբար β-գալակտոզիդազը, պերմեազը և ացետիլտրանսֆերազը:lacZ-ը հիդրոլիզացնում է լակտոզը գլյուկոզայի և գալակտոզայի կամ ալլո-լակտոզայի մեջ;lacY-ն թույլ է տալիս շրջակա միջավայրում գտնվող կաթնաշաքարն անցնել բջջային թաղանթով և ներթափանցել բջիջ;lacA-ն ացետիլ խումբը տեղափոխում է ացետիլ-CoA-ից β-գալակտոզիդ, որը ներառում է Թունավոր էֆեկտի վերացում:Բացի այդ, կա O գործող հաջորդականություն, մեկնարկային հաջորդականություն P և I կարգավորող գեն: I գենի կոդը ռեպրեսորային սպիտակուց է, որը կարող է կապվել օպերատորի հաջորդականության O դիրքի հետ, այնպես որ օպերոնը (մետա) ճնշվում է և անջատված.Գոյություն ունի նաև կատաբոլիկ գենի ակտիվացնող պրոտեին-CAP կապող տեղամասի կապող տեղամաս՝ սկզբնական P հաջորդականության վերևում:Երեք ֆերմենտների կոդավորող գեները կարգավորվում են միևնույն կարգավորող շրջանով՝ հասնելու գենային արտադրանքների համակարգված արտահայտմանը:

Լակտոզայի բացակայության դեպքում լակ օպերոնը (մետա) գտնվում է ռեպրեսիայի վիճակում։Այս պահին I հաջորդականությամբ արտահայտված lac ռեպրեսորը PI պրոմոտորի հաջորդականության հսկողության տակ կապվում է O հաջորդականության հետ, ինչը կանխում է ՌՆԹ պոլիմերազի միացումը P հաջորդականությանը և արգելակում տրանսկրիպցիան սկսելը;երբ առկա է լակտոզա, լակ օպերոնը (մետա) կարող է առաջանալ Այս օպերոնային (մետա) համակարգում իրական ինդուկտորը ինքը լակտոզան չէ:Լակտոզը ներթափանցում է բջիջ և կատալիզացվում β-գալակտոզիդազով, որպեսզի այն վերածվի ալոլակտոզայի:Վերջինս, որպես ինդուկտոր մոլեկուլ, կապվում է ռեպրեսորային սպիտակուցի հետ և փոխում սպիտակուցի կոնֆորմացիան, ինչը հանգեցնում է ռեպրեսորային սպիտակուցի տարանջատմանը O հաջորդականությունից և տրանսկրիպցիայից։Իզոպրոպիլթիոգալակտոզիդը (IPTG) ունի նույն ազդեցությունը, ինչ ալոլակտոզը:Այն շատ հզոր ինդուկտոր է, որը չի մետաբոլիզացվում բակտերիաների կողմից և շատ կայուն է, ուստի լայնորեն կիրառվում է լաբորատորիաներում։

Ինչպե՞ս որոշել IPTG-ի օպտիմալ կոնցենտրացիան:Որպես օրինակ վերցրեք E. coli-ն:
E. coli BL21 գենետիկորեն մշակված շտամը, որը պարունակում է դրական ռեկոմբինանտ pGEX (CGRP/msCT) պատվաստվել է LB հեղուկ միջավայրում, որը պարունակում է 50 μg·mL-1 Amp, և աճեցրել է գիշերը 37°C-ում:Վերոնշյալ մշակույթը պատվաստվել է 10 շիշ 50 մլ թարմ LB հեղուկ միջավայրում, որը պարունակում է 50 μg·mL-1 Ամպեր 1:100 հարաբերակցությամբ ընդարձակման մշակույթի համար, և երբ OD600 արժեքը եղել է 0.6-0.8, վերջնական կոնցենտրացիային ավելացվել է IPTG:Այն կազմում է 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0մմոլ·Լ-1։Նույն ջերմաստիճանում և նույն ժամանակում ինդուկցիայից հետո դրանից վերցվել է 1 մլ բակտերիալ լուծույթ, և բակտերիալ բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ և ենթարկվել SDS-PAGE-ի՝ վերլուծելու տարբեր IPTG կոնցենտրացիաների ազդեցությունը սպիտակուցի արտահայտման վրա, այնուհետև ընտրեք IPTG կոնցենտրացիան սպիտակուցի ամենամեծ արտահայտությամբ:
Փորձերից հետո կպարզվի, որ IPTG-ի կոնցենտրացիան հնարավորինս մեծ չէ։Դա պայմանավորված է նրանով, որ IPTG-ն ունի որոշակի թունավորություն բակտերիաների համար:Կոնցենտրացիայի գերազանցումը կսպանի նաև բջիջը.և ընդհանրապես, մենք հուսով ենք, որ որքան շատ լուծվող սպիտակուց արտահայտված լինի բջջում, այնքան լավ, բայց շատ դեպքերում, երբ IPTG-ի կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, մեծ քանակությամբ ներառականություն կձևավորվի:Մարմինը, բայց լուծվող սպիտակուցի քանակը նվազել է։Հետևաբար, IPTG-ի ամենահարմար կոնցենտրացիան հաճախ ոչ թե որքան մեծ է, այնքան լավ, այլ որքան ցածր է կոնցենտրացիան:
Գենետիկորեն մշակված շտամների ինդուկցիայի և աճեցման նպատակն է բարձրացնել թիրախային սպիտակուցի բերքատվությունը և նվազեցնել ծախսերը:Թիրախային գենի արտահայտման վրա ազդում են ոչ միայն շտամի սեփական գործոնները և արտահայտման պլազմիդը, այլ նաև արտաքին այլ պայմանները, ինչպիսիք են ինդուկտորի կոնցենտրացիան, ինդուկցիոն ջերմաստիճանը և ինդուկցիայի ժամանակը:Հետևաբար, ընդհանուր առմամբ, նախքան անհայտ սպիտակուցը արտահայտելը և մաքրելը, լավագույնն է ուսումնասիրել ինդուկցիայի ժամանակը, ջերմաստիճանը և IPTG-ի կոնցենտրացիան՝ համապատասխան պայմանները ընտրելու և լավագույն փորձնական արդյունքները ստանալու համար: